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关于血液基因组提取,你应该知道的事

 

背景:随着分子生物学技术的发展,基因组水平上的研究已成为热点。在分子遗传学和分子流行病学中,无论是全基因组关联分析GWAS(Genome-Wide Association Studies)、候选SNP(Single Nucleotide Polymorphism)位点基因分型,还是基因组文库的建立,都需要从大批量血液样本中提取基因组DNA。因此,如何能够从血液样本中提取高质量、高纯度的DNA成为下游试验中最关键的一步。

 

为了更好的获得高质量、高纯度的DNA,那么我们首先应该了解血液的组成是什么?


 

 

图源:

https://www.khanacademy.org/science/biology/humanbiology/circulatorypulmonary/a/components-of-the-blood

 

1.血液的组成

血液是动物体内的一种体液,可向细胞输送必要的物质,如营养和氧气,并将代谢废物从这些细胞中运走。血液的成分包括血浆(液体部分,含有水、蛋白质、盐、脂质和葡萄糖)红细胞、白细胞和血小板


 

图源:

https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/


人体血液的细胞和细胞成分:红细胞向细胞输送氧气并去除二氧化碳。白细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)参与免疫反应。血小板形成凝块,防止受伤后失血。

 

a、血浆:
血浆是去除所有细胞和血小板后的血液液体成分,约占总血量的 55%。血浆由 90% 的水和抗体、凝血因子以及维持身体所需的电解质、脂质和蛋白质组成。

 

b、红细胞:
红细胞Red blood cells或erythrocytes,erythro- = “红色”;-cyte = “细胞”)是一种通过身体循环向其他细胞输送氧气的特殊细胞,由骨髓中的干细胞形成,约占总血量的 45%。在哺乳动物中,红细胞是小的双凹细胞,成熟时不含细胞核或线粒体。它们的大小只有 7–8 µm。在鸟类和非鸟类爬行动物中,红细胞含有一个细胞核。


图源:NHLBI (public domain)


红细胞的颜色来自含铁蛋白质血红蛋白,在大多数哺乳动物中,红细胞没有任何细胞器(例如细胞核、线粒体)。无脊椎动物使用不同的色素来结合和携带氧气。例如血蓝蛋白(一种蓝绿色、含铜的蛋白质)、氯红素(一种绿色、含铁的色素)和蚯蚓血红蛋白(一种红色、含铁的蛋白质)。


 

图源:

https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/

  1. 血红蛋白 b. 血蓝蛋白 c. 蚯蚓血红蛋白

 

c.白细胞:
白细胞(White blood cells或 leukocytes,leuko = 白色约占总血量不到 1%。白细胞的作用与红细胞的作用非常不同。它们主要参与识别和靶向病原体的免疫反应,例如入侵的细菌、病毒和其他外来生物。


 

图源:

https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/


白细胞的类型:(a) 粒性细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)的特征在于细胞质中的叶状核和粒状包涵体。粒细胞通常是受伤或感染期间的第一反应者。(b) 无粒细胞包括单核细胞和淋巴细胞。单核细胞分化成巨噬细胞和树突状细胞,进而对感染或损伤作出反应。淋巴细胞,包括 B 细胞和 T 细胞,负责适应性免疫反应。

 

d.血小板:
血小板是由称为巨核细胞的较大细胞分解形成的。对于每个巨核细胞,形成 2000-3000 个血小板,每立方毫米血液中存在 150,000 至 400,000 个血小板。每个血小板呈圆盘状,直径为 2-4 μm,它们包含许多小囊泡,但不包含细胞核。

 

 

(a) 血小板是由称为巨核细胞的大细胞形成的。巨核细胞分裂成数千个碎片,成为血小板。(b) 血小板与其他凝血因子(例如纤维蛋白原)一起聚集在伤口部位,形成纤维蛋白凝块,防止失血并使伤口愈合。

 

2.血液基因组提取方法

 

 

a.盐析方法:
经典盐析法提取血液DNA,其方法为溶解红细胞后,离心沉渣用PK消化,用大约6M饱和NaCl沉淀蛋白质,离心上清中DNA用无水乙醇沉淀,用TE溶解。此方法提取的DNA质量尚可,但产率较低,并且纯度较差。

 

b.有机溶剂方法:
有机法提取DNA一般是指用平衡酚(又叫饱和酚)、氯仿等按不同比例混合,采用不同方法提取DNA。此方法操作繁琐,耗时久,且所用试剂具有一定的毒性。

 

c.柱法(硅膜法):

特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA(低盐、高pH值情况下释放DNA),配备设计独特的离心吸附柱式结构,使用常规台式高速离心机,在30-60min之内即可以高效回收核酸片段。此方法操作简便,但依赖人工操作,很难实现自动化。

 

d.磁珠法:
异硫氰酸胍是强烈蛋白变性剂,不破坏蛋白质一级结构,能破坏细胞膜及核膜蛋白,并使核酸酶失活,释放DNA。磁珠可以特异性吸附DNA,通过洗涤液洗涤,在仅留有特异吸附DNA的磁珠中加入洗脱液,DNA释放于洗脱液中。此方法自动化程度高,可满足高通量提取的需求,是未来核酸提取的发展方向。

 

3.济凡磁珠法大体积血液核酸提取

近些年,随着医院和第三方独立医学实验室等医疗机构建立DNA样本库的需求越来越广泛,1~4mL大体积全血DNA提取的工作量迅速增加,传统的手工操作已经不能满足建立DNA样本库的要求,采用自动化工作站进行大体积全血DNA的快速提取已经成为大势所趋。


目前市面上大体积全血DNA提取多采用裂解红细胞前处理、吸附柱等方法从全血中提取DNA,这些方法具有操作繁琐、通量小、耗时等特点。济凡生物正在研发的新型核酸提取试剂,可搭配24通道自动核酸提取仪进行大体积血液核酸提取。无需裂红前处理,机上裂解,一次可提取24个样本,整个过程在2h内完成。


图:济凡24通道核酸自动提取仪(适配大体积血液提取)


示例:济凡磁珠法大体积血液提取2 mL全血(300 μL 洗脱)

由以上结果可以看出:济凡磁珠法大体积血液提取2 mL全血,DNA得率在70-78 μg之间,A260/A280在1.8-2.0左右,A260/A230在1.8-2.0左右。

 

参考文献:

1.Components of the Blood 

 

https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/

 

2.Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988 Feb 11;16(3):1215. doi: 10.1093/nar/16.3.1215. PMID: 3344216; PMCID: PMC334765.

 

3.Buedts L, Smits S, Ameye G, Lehnert S, Ding J, Delforge M, Vermeesch J, Boeckx N, Tousseyn T, Michaux L, Vandenberghe P, Dewaele B. Ultra-low depth sequencing of plasma cell DNA for the detection of copy number aberrations in multiple myeloma. Genes Chromosomes Cancer. 2020 Aug;59(8):465-471. doi: 10.1002/gcc.22848. Epub 2020 May 5. PMID: 32259320.