干货分享 | 新冠病毒核酸rRT-PCR分析注意事项

题目：rRT-PCR for SARS-CoV-2: Analytical considerations

期刊：Clinica Chimica Acta 516（2021）1-7

通讯作者：Mohammad Abdi

DOI号：10.1016/j.cca.2021.01.011

编译：俞萍

一、背景介绍

新冠疫情仍然是全世界卫生系统面临的一个重大问题。早期准确检测新冠病毒感染对于最大限度地减少传播和治疗至关重要。在检测方法中，实时逆转录聚合酶链式反应(rRT-PCR)被认为是金标准。

该检测方法具有较高的特异性和灵敏性，但对于有症状的或CT扫描呈阳性的患者中出现假阴性结果来说仍然是一个挑战。误差来源可能是分析前(采样、储存和处理)、分析中(RNA提取、cDNA合成和扩增)和分析后(解释和分析)。文章总结了这些潜在的误差来源和减少误差的措施。

二、分析前误差

分析前最重要的误差来源之一发生在取样步骤中。其中最关键的是正确的采样位置，包括鼻子、喉咙和气管导管等，要使用标准采样耗材（尼龙植绒而非棉签）进行采样，拭子应在适当位置保持10秒并旋转三次。采样过程中，如果拭子被手套粉末、喉咙末端的食物碎屑等污染物浸透，会对结果的准确性产生不利影响。

取样后将这些误差降至最低的方法是将拭子快速转移到合适的运输介质中，并快速送到实验室，同时控制运输温度（2–8℃）和时间（72小时内）。

不正确的取样和储存可能是产生错误结果的重要来源，特别是在病毒载量低的样本中。多项研究表明，在疾病的早期阶段，病毒大多位于鼻部，因此在此期间从喉咙中采样更可能是假阴性，建议在症状出现后5或6天采集鼻咽和口咽拭子。

三、分析中误差

分析中重要误差可能发生在核酸提取步骤中，对所提取RNA的数量和质量有很大影响。核酸提取过程中的主要污染蛋白是核酸结合蛋白，它可以干扰cDNA合成反应，特别是PCR过程。选择合适的RNA提取方法是获得有效结果的关键步骤，自动化磁珠法核酸提取被认为是最安全和最快的方法，这种方法只需要很少的人工干预。

内源性和外源性核糖核酸酶降解RNA也可能影响提取RNA的质量和数量，并导致假阴性结果。最终洗脱的核糖核酸应溶于不含RNA酶的水中，以防止RNA降解导致假阴性结果。核酸提取过程中有几种试剂会降低PCR效率，如手套粉末、盐、去污剂以及苯酚和乙醇等有机分子，因此在RNA提取过程中应避免使用或尽量减少使用。此外，避免提取的核酸暴露于紫外线照射也很重要。同时为了避免分子实验室环境受到气溶胶的影响，需要分区域实验。

cDNA合成和扩增中引物和探针的储存也是重要因素，反复冻融和长时间的光暴露降低了稳定性和反应效率。准确移取RNA和酶在cDNA合成过程中起主要作用，移液方法和移液器应该都是校验过的。在一步法的RNA逆转录和cDNA扩增中，对于RNA水平较低的样本，扩增效率低导致错误分析时有发生。高浓度的逆转录酶对扩增有抑制作用。

PCR仪校准发生故障也有可能导致不准确的扩增温度和循环时间。新冠病毒rRT-PCR检测中最重要的挑战之一是选择效率最高的引物，已证实ORF1ab、N和RdRp引物比其他引物具有更高的敏感性、特异性和阳性预测价值。病毒基因组发生突变和重组，使得新冠肺炎检测相当困难。为了提高方法的灵敏度并克服这一问题，应更多地考虑引物浓度、引物退火和设计用于多靶点检测的引物，在筛选扩增程序中应考虑使用不同引物的组合策略来提高检测能力。

通过常用rRT-PCR方法产生假阴性结果的最重要原因之一是病毒载量低导致，研究表明数字PCR在检测低病毒载量样本方面比rRT- qPCR具有更高的灵敏度和特异性。

四、分析后误差

新冠肺炎检测相关的分析后误差并不是很多。最常见的误差来源之一是操作员对数据的错误解读。通过基线、阈值和扩增曲线绘制精确的图表，并确保检测灵敏度，可以大大降低这些错误解读的可能性。频繁冻融标准溶液也会增加CT值，所以标准溶液应避免反复冻融影响结果判读。

扩增曲线对于确定基线和阈值循环很重要，新冠肺炎阳性的rRT-PCR结果的CT值应小于40，大于40的结果应视为阴性结果。CT值为37–40的样本必须重新取样检测。

对内标无扩增首先分析PCR过程是否有问题。如果PCR重复结果还是如此，则需要重新取样检测。实时PCR是一种非常灵敏的方法，因此移液、组分质量、设备校准和温度等都可能会导致结果不稳定和不准确。因此，使用内标可以提高PCR过程的准确性。

实时逆转录聚合酶链反应的效率是一个关键因素。最佳效率为90 ~ 110%，最佳扩增效率是获得准确PCR结果的必要条件，在进行数据分析之前应予以考虑。

五、结论

文章总结分析了假阴性或假阳性结果的一些可能来源。分析前误差被认为是新冠肺炎诊断中的主要可能误差来源，包括采样耗材、采样位置和采样时间。在分析阶段，RNA提取是主要关注点，其数量和质量是重要因素。同时通过引物设计、储存条件、PCR组分和移液器校准来优化rRT-PCR过程，如果病毒基因组发生突变，则应优化新的引物。

在分析后阶段，必须使用各种阳性和阴性对照品来确认和解释结果。因此，使用质控品对每次检测都至关重要，同时分析解释数据的人员应该具有专业知识和能力。

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