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质粒提取秘籍,你Get到了吗?

  • 分类:产品动态
  • 作者:
  • 来源:
  • 发布时间:2022-06-23 09:13
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【概要描述】

质粒提取秘籍,你Get到了吗?

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质粒是基因工程中最常用的载体工具,方便目的DNA片段的插入整合进而获得重组质粒,然后导入宿主细胞,最后利用质粒上的功能元件,实现目的DNA片段的复制、转录以及相应蛋白的表达。

 

除了在科研领域的普遍应用,重组质粒已广泛应用在多类生物医药产品研发生产中,例如重组蛋白药物、质粒DNA疫苗、基因治疗药物以及CAR-T药物等。目前,质粒已是基因工程实施过程中的一个基础工具。

 

高品质质粒的获得是下游各项实验成功的重要保障。质粒提取主要包括三个基本步骤:质粒DNA在菌体细胞内的扩繁、质粒DNA从菌体细胞中的裂解释放和裂解液中游离质粒DNA的分离与纯化。碱裂解法是最常用的质粒DNA提取方法,根据共价闭合环状质粒DNA与线性基因组DNA的拓扑学结构差异导致的变性-复性速率不同进行分离,具有得率高,适用广,提取快速等特点。

 

质粒提取之后,可以使用多种方法评价提取的质量。一般评价质粒提取效果的指标包括得率、纯度和超螺旋质粒比例和内毒素含量。紫外分光光度法一般用于测定质粒得率和纯度,当测值OD260/280=1.7-1.9、OD260/230>2时表示质粒纯度较好;同时,结合琼脂糖凝胶电泳法观察质粒样品在凝胶中带型、大小和亮度,可以判断浓度、超螺旋质粒比例和纯度(主要是基因组DNA、RNA和蛋白等残留)。质粒样本在琼脂糖凝胶中的最理想状态是呈现单一的超螺旋条带,但多数情况是会呈现2条或3条带。这是由质粒的不同构型在凝胶电泳中的泳动速率不同造成的,超螺旋质粒跑的最快,其条带越亮表明质粒完整性越好。在对质粒DNA纯度要求高的应用场景中,内毒素水平也是一个非常重要的指标。内毒素含量测定通常采用金标准的鲎试剂法定量检测,当内毒素含量低于0.1EU / µg 时,通常被认为是无内毒素质粒。

 

那么,如何提取到高质量的质粒、提高下游实验的成功率呢?经验表明,质粒质量受多种因素影响,除了试剂盒本身性能外,也与宿主菌株,培养基类型,培养条件,质粒类型,质粒大小和拷贝数等有关。

 

菌株类型

用于提取质粒的宿主菌大多数是大肠杆菌,而菌株类型往往会对质粒 DNA的提取质量产生较大影响。DH5α 和XL1-Blue是较为常用的宿主菌株,转化效率较高,质粒产量较大,通常可以满足高质量质粒 DNA的制备。其他菌株如 HB101,裂解时则会释放大量的糖类代谢物,如果残留较多,会抑制后续的酶促反应,进而对提取的质粒 DNA质量带来不利影响。此外,含有较高内切酶活性的宿主菌株,会降低质粒DNA得率。因此,宿主菌株的类型需要根据具体用途来做出选择。

 

质粒类型

质粒的大小和拷贝数均一定程度影响质粒得率。通常来讲,质粒越大或插入的DNA片段越大,质粒DNA产量越低。细菌中质粒的拷贝数主要决定于质粒本身的复制特性。对于低拷贝质粒,菌液量往往需要更多才能获得较高的质粒浓度。而且,部分细菌菌株内,可以选择在培养阶段加入氯霉素,以提高宿主细胞的质粒产量。

 

菌液投入量

由于菌体生长的营养类型,生长条件(振荡速度、温度、时间),宿主菌株或质粒插入类型等的影响,细菌培养的最终细胞浓度变化范围极大。根据经验值,OD600为1的1升大肠杆菌培养液包含1×1012个细胞,细胞湿重约为1.5-1.8g。由于菌液体积不能反映出细菌细胞浓度与重量,而细胞重量的测定具有一定局限性,所以采用两个便于测量的变量值的乘积作为提取质粒前确定菌量的标准(ODV=菌液吸光值OD600×菌液体积V)。以济凡质粒大提试剂盒为例,测试菌液样本的ODV值与质粒得率的相关性,结果表明,质粒DNA得率与投入菌量显著相关。菌体投入量过多易导致菌体裂解不充分,质粒得率下降。因此,选择适当的菌液量是提高质粒得率的关键因素。

 

 

菌体培养条件

对于含常规的高拷贝质粒宿主菌的培养,推荐使用 LB (Luria-Bertani) 培养基。为了使细菌生长获得最佳条件,可使用至少3倍培养基体积的三角瓶培养细菌,以提供充足的氧饱和环境。2 x YT、TB (Terrific Broth)等富营养培养基也可选择用于高拷贝质粒宿主菌的培养。此外,当宿主菌株接种到培养基中时必须加入抗生素进行筛选培养。摇床的摇晃速度、温度和时间等都会对细菌生长产生重要影响。菌体振荡培养时间不应过长,过度生长会使菌体细胞死亡裂解,导致质粒 DNA丢失或变异。为了提取高质量的质粒,需要找到细菌扩增繁殖的最优条件。

 

内毒素去除

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁上存在的一类脂多糖物质的总称,单位用EU表示。内毒素在细菌细胞生长过程中会有少量内毒素释放,当细胞大量死亡或裂解时会释放出大量内毒素。游离的内毒素分子会激活哺乳动物免疫系统产生炎症反应。因此,对于内毒素敏感细胞转染实验或动物活体实验,需要在制备质粒时尽可能清除内毒素,以保证较高的细胞转染效率和排除内毒素对活体实验的干扰。根据实验需求的不同,选择相对应的质粒提取试剂盒可事半功倍。济凡质粒大提试剂盒,引入了可选择的内毒素清除步骤,以满足不同的质粒应用场景。对于内毒素非敏感细胞,可直接省掉内毒素清除步骤;而对于内毒素敏感细胞,可选择加入内毒素清除步骤,一盒两用,简单方便。

 

提取与纯化操作

裂解细菌细胞并释放质粒的方法有很多,如煮沸法,梯度离心法、碱裂解法等。由于碱裂解法操作简单,且处理方式温和,市面上应用较多。要获得高质量质粒DNA,一定不能忽略菌体裂解步骤,在加入SDS-NaOH后不要剧烈震荡,容易导致质粒DNA断裂,影响完整性,且易混入小片段基因组DNA,影响质粒纯度。纯化质粒目前已发展出多种方法,如盐析法、硅胶介质吸附法,阴离子交换树脂法等,盐析法一般涉及有毒试剂,操作并不友好。阴离子交换树脂法获得的质粒得率和纯度都较好,但成本较高。使用比较广泛的是硅胶介质吸附法,该方法制备的质粒得率、纯度都较优,成本也相对较低,可满足大部分客户需求。质粒纯化时需要考虑不同产品中吸附柱对质粒DNA的吸附能力,若样本质粒量很大,可分多次分离纯化。漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,确保质粒中无乙醇残留。济凡质粒提取试剂盒具有较优的菌体裂解性能和质粒纯化性能。

 

保存方法

提取后的质粒除了本身质量外,也应注意提供适宜的保存环境,以防止质粒降解影响下游应用,一般质粒可保存于TE溶液中,在4℃短期保存,在-80℃或-20℃中长期保存。除了直接保存质粒,还应将含质粒的宿主菌保存于甘油中,-80℃或液氮中可长期保存。

 

当然,除了以上介绍的操作要点之外,一款操作方便、提取效率高的试剂也是必不可少的。济凡生物是一家集研发、生产、销售和技术服务为一体的国家高新生物技术企业,致力于为科研、工业医疗以及生物医药领域提供稳定可靠、高性价比的产品解决方案和专业技术服务。济凡质粒大提试剂盒经研发精心设计优化,可以大幅提高质粒提取质量,解决客户实验中可能遇到的得率低,纯度低,内毒素高等问题,是当之无愧的实验好帮手。

 

FinePure无内毒素质粒大提试剂盒(升级版)

  • 得率高、纯度好:独特的玻璃纤维素膜吸附技术,高效专一结合质粒DNA;

  • 内毒素清除步骤灵活:含内毒素清除Buffer,根据下游不同需求可选择性加入或去掉该步骤,操作简单方便,适用范围广;

  • 时间短:整个提取过程50min左右;

  • 应用广:提取的质粒可满足下游克隆、酶切、测序和细胞转染等实验

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